Μετά τον ενοφθαλμισμό των κλινικών δειγμάτων στα θρεπτικά υλικά, οι καλλιέργειες επωάζονταιστον κλίβανο. Τα ταχέως αναπτυσσόμενα αερόβια και δυνητικώς αναερόβια βακτήρια (τα συχνότερα απαντώμενα στην καθημερινή κλινική πράξη) αναπτύσσονται ικανοποιητικά μετά από 18-24 ώρες επώασης σε αερόβιες συνθήκες.
Την επόμενη ημέρα, τα τρυβλία εξετάζονται και η διαδικασία της ταυτοποίησης ξεκινάει με βάση την παρατήρηση των καλλιεργητικών χαρακτηριστικών. Τέτοια είναι οι διατροφικές και ατμοσφαιρικές απαιτήσεις, η παραγωγή χρώματος, η ικανότητα ανάπτυξης παρουσία ορισμένων ουσιών όπως χολικά άλατα, NaCl, ή σε ορισμένα υλικά όπως MacConkey, η ικανότητα ανάπτυξης σε συγκεκριμένη θερμοκρασία, η ικανότητα πρόκλησης αιμόλυσης στο αιματούχο άγαρ και το είδος της (α, β, γ).
Για τους μύκητες η μορφολογία της αποικίας (ως βλαστομύκητας ή υφομύκητας) είναι η πρώτη σημαντική διάκριση. Για τους υφομύκητες η ταυτοποίηση βασίζεται στη μορφολογία των υφών και των συναφών δομών (υφές, κονίδια)
ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ
Τα βακτήρια και οι ζυμομύκητες (βλαστομύκητες) ταυτοποιούνται με βάση το πρότυπο (προφίλ) βιοχημικών ιδιοτήτων τους, δηλαδή την ικανότητα αντίδρασης με διάφορα υποστρώματα προς παραγωγή συγκεκριμένων μεταβολικών προϊόντων. Υπάρχουν βάσεις δεδομένων σε ΗΥ που περιέχουν τα συνηθέστερα χαρακτηριστικά πρότυπα αντίδρασης (προφίλ) των διαφόρων ειδών βακτηρίων και ζυμομυκήτων και μέσω σύγκρισης με αυτά προσδιοριζεται η πιθανότερη ταυτοποίηση του υπό έλεγχον μικροοργανισμού.
Μερικές από τις συχνότερα χρησιμοποιούμενες αντιδράσεις βιοχημικής ταυτοποίησης είναι οι παρακάτω: (μερικές αναλύονται λίγο περισσότερο). Με εξαίρεση τις αντιδράσεις καταλάσης, κοαγκουλάσης και αναγωγής των νιτρικών οι υπόλοιπες εφαρμόζονται για τη διάκριση μεταξύ των ειδών των Εντεροβακτηριακών, που είναι από τα συχνότερα απομονούμενα μικρόβια σε κλινικά δείγματα στην καθημερινή κλινική πράξη.
Αντίδραση καταλάσης
Το ένζυμο καταλάση καταλύει τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και αέριο οξυγόνο. Όταν μια αποικία τοποθετηθεί μέσα σε υπεροξείδιο του υδρογόνου παρατηρείται η απελευθέρωση φυσαλίδων οξυγόνου. Η δοκιμασία αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τη διάκριση των σταφυλοκόκκων (όλοι θετικοί) από τους στρεπτοκόκκους (όλοι αρνητικοί).
Άλλα γένη βακτηρίων που παράγουν καταλάση είναι η Moraxella και ο Bacillus.
Αντίδραση κοαγκουλάσης ή πηκτάσης.
Το ένζυμο κοαγκουλάση (ή πηκτάση) μετατρέπει το ινωδογόνο του πλάσματος σε ινική. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τη διάκριση του Staphylococcus aureus από άλλους σταφυλοκόκκους που χαρακτηρίζονται κοαγκουλάση-αρνητικοί KAΣ (coagulase negative staphylococci, CNS ή CoNS). Οι γνωστότεροι CoNS είναι οι S. epidermidis και S. saprophyticus.
Αντίδραση δεσοξυριβονουκλεάσης (DNάσης).
Η DNάση είναι εξωκυττάριο ένζυμο που υδρολύει το DNA. Ο Staphylococcus aureus παράγει μια θερμοσταθερή DNAάση την οποία χρησιμοποιούμε για τη διάκρισή του από τους άλλους σταφυλοκόκκους, που παράγουν λιγότερη ή καθόλου. Ανιχνεύουμε το ένζυμο ενοφθαλμίζοντας το υπό έλεγχον μικρόβιο σε θρεπτικό άγαρ που περιέχει DNA. Μετά την επώαση (18-24h) πλημμυρίζουμε το υλικό με υδροχλωρικό οξύ, το οποίο καθιζάνει το DNA, προκαλώντας θόλωση του υλικού. Αν το μικρόβιο παράγει DNάση, η περιοχή γύρω από την αποικία του θα είναι διαυγής (γιατί το DNA θα έχει καταστραφεί).
Εναλλακτικά, η ανίχνευση DNάσης μπορεί να γίνει σε άγαρ που περιέχει τη μεταχρωματική ουσία κυανούν της τολουϊδίνης, η οποία όταν είναι σε σύμπλοκο με το DNΑ έχει μπλέ χρώμα αλλά εάν το DNΑ υδρολυθεί, η χρωστική αλλάζει χρώμα σε ροζ (δεξιά εικόνα). DNάση παράγουν επίσης ο Streptococcus pyogenes, η Serratia marcescens και το Corynebacterium diphtheriae.
Γλυκοσιδάσες
Η γνωστότερη γλυκοσίδη είναι η εσκουλίνη, μια φυσική γλυκοσίδη, η οποία υδρολύεται από μια γλυκοσιδάση, τη β-γλυκοσιδάση σε γλυκόζη και εσκουλετίνη. Παρουσία αλάτων σιδήρου, η εσκουλετίνη σχηματίζει μια χηλική ένωση καφέ-μαύρου χρώματος. Η υδρόλυση της εκσουλίνης παρουσία χολής είναι χρήσιμη δοκιμασία για τη διαφοροποίηση του Enterococcus και των στρεπτοκόκκων της ομάδας D από τους υπόλοιπους στρεπτοκόκκους. Η υδρόλυση της εσκουλίνης χρησιμεύει και στη διαφοροποίηση των ειδών της οικογένειας των Εντεροβακτηριακών.
Διάσπαση ONPG (O-Nitrophenyl-a-D-galactoside).
Η δοκιμασία ONPG ελέγχει την παραγωγή του ενζύμου β-γαλακτοσιδάση και αφορά τη ζύμωση της λακτόζης (ακολουθούν γνώσεις για επαγγελματίες, μπορείτε να σταματήσετε να διαβάζετε ΕΔΩ, με bold και υπογραμμισμένα αυτά που πρέπει να ξέρετε). Θεωρείται θετική όταν παράγεται κίτρινο χρώμα στην αντίδραση που βλέπετε παρακάτω..
Προκειμένου ένα βακτήριο να φαίνεται ότι ζυμώνει τη λακτόζη πρέπει να διαθέτει 1. περμεάση, ένζυμο για εισαγωγή της λακτόζης στο κύτταρο και 2. β-γαλακτοσιδάση για τη ζύμωσή της. Αν το βακτήριο διαθέτει και τα δύο ένζυμα θα είναι ONPG-θετικό και ζυμούν τη λακτόζη, αν διαθέτει μόνο τη β-γαλακτοσιδάση αλλά όχι την περμεάση θα είναι ONPG-θετικό αλλά θα φαίνεται ότι δε ζυμώνει τη λακτόζη. Έτσι έχουμε τις εξής κατηγορίες:
Μη ζυμούντα τη λακτόζη – ONPG-αρνητικά : Salmonella spp Shigella spp Proteus spp Providencia spp Morganella spp που δεν παράγουν β-γαλακτοσιδάση.Χρησιμοποίηση κιτρικών. Σε άγαρ που περιέχει ως μοναδική πηγή άνθρακα το κιτρκό νάτριο ελέγχεται η ικανότητα χρησιμοποίησής του από ορισμένα βακτήρια, που χαρακτηρίζονται θετικά στα κιτρικά. Θετική δίνουν την αντίδραση οι Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Providencia. Αρνητική οι Escherichia, Shigella, Morganella, Yersinia κ.ά.
Ζυμούντα τη λακτόζη – ONPG-θετικά : E.coli, Klebsiella spp Enterobacter spp που παράγουν και περμεάση και β-γαλακτοσιδάση
Βραδέως ζυμούντα τη λακτόζη – ONPG-θετικά : Citrobacter spp, Arizona spp παράγουν μόνο β-γαλακτοσιδάση όχι περμεάση και γιαυτό ζυμώνουν αργά τη λακτόζη.
Αποκαρβοξυλάσες και Δεαμινάσες.
Η αποκαρβοξυλίωση και απαμίνωση των αμινοξέων λυσίνης, αργινίνης και ορνιθίνης διαπιστώνεται με την μεταβολή χρώματος λόγω αλλαγής του pH ή λόγω παραγωγής έγχρωμων προϊόντων και χρησιμοποιείται κυρίως στην ταυτοποίηση των Gram-βακτηριδίων.
Παραγωγή υδροθείου.
Ορισμένα βακτήρια παράγουν H2S από αμινοξέα ή άλλες ουσίες, το οποίο ανιχνεύεται με την παραγωγή μαύρου χρώματος κατά την αντίδραση του H2S με βαρέα μέταλλα όπως σίδηρο. Θετική δίνουν αυτή την αντίδραση παραγωγής υδροθείου μικρόβια του γένους Salmonella και Proteus.
Αντίδραση Ινδόλης.
Η αντίδραση ινδόλης ελέγχει την ικανότητα ενός μικροοργανισμού να παράγει ινδόλη, μια βενζοπυρρόλη από το αμινοξύ τρυπτοφάνη. Η παραγωγή ινδόλης ανιχνεύεται με το σχηματισμό κόκκινου χρώματος μετά την προσθήκη ενός αντιδραστηρίου (βενζαλδεΰδης).
Αναγωγή νιτρικών
Η αναγωγή των νιτρικών από τα βακτήρια διαπιστώνεται με την ανίχνευση των παραγόμενων νιρωδών ή / και αερίου αζώτου. Είναι μια αντίδραση που δίνουν θετική όλα τα Εντεροβακτηριακά.
Αντίδραση οξειδάσης
Ανιχνεύει το συστατικό c του συμπλέγματος της κυτοχρωμικής οξειδάσης. Το αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται (tetramethyl-p-phenylene-diamine) μεταβάλλεται από άχρωμο σε έγχρωμο (μωβ) όταν οξειδώνεται (επειδή το μικρόβιο διαθέτει το ένζυμο κυτοχρωμική οξειδάση). Θετική την αντίδραση οξειδάσης δίνουν μεταξύ άλλων τα γένη Pseudomonas, Neisseria, Aeromonas, Campylobacter, Vibrio, Brucella και Pasteurella.
Ανίχνευση πρωτεασών.
Η ανίχνευση πρωτεολυτικής δραστηριότητας γίνεται με ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε υποστρώματα όπως ζελατίνη ή αυγό.Γελατινάση παράγουν συνήθως τα Proteus spp. και Serratia spp. Ομοίως οι Bacillus anthracis και Bacillus cereus και Clostridium tetani και Clostridium perfringens.
Παραγωγή ουρεάσης
Η ουρεάση υδρολύει την ουρία σε 2 μόρια αμμωνίας και 1 CO2. Η παραγωγή αμμωνίας αυξάνει το pH και το χρώμα του δείκτη αλλάζει σε έντονο ροζ. Την αντίδραση αυτή δίνουν θετική βακτήρια του γένους Brucella, Helicobacter, Proteus, Morganella, Ureaplasma, Corynebacterium και ο βλαστομύκητας Cryptococcus.
Διάσπαση υδατανθράκων (σακχάρων)
Η ικανότητα ζύμωσης ή οξείδωσης διαφόρων σακχάρων (γλυκόζη, σουκρόζη, λακτόζη) με παραγωγή οξέος χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση των περισσοτέρων βακτηρίων. Στα αναερόβια βακτήρια εφαρμόζεται η αέριος χρωματογραφία για ταυτοποίηση λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας.
Επάνω : όλες οι δοκιμασίες θετικές, κάτω όλες αρνητικές.
